Bio-Rad 1610374 Precision Plus Protein Dual Color Standards說明書

基本信息概覽：

• 產品品牌： 伯樂（Bio-Rad）

• 英文全名： Precision Plus Protein Dual Color Standards

• 中文譯名： Precision Plus 蛋白質雙色標準品（常被稱為雙色預染蛋白Marker或蛋白梯）

• 產品貨號： 1610374

• 產品規格： 500 μl（微升）

• 應用次數： 約50次應用（按每次電泳上樣10 μl計算）

• 分子量范圍： 10 kDa – 250 kDa

• 條帶數量： 共計10條 distinct（界限分明）的重組成蛋白條帶

• 染料特征： 8條藍色染色條帶，2條粉紅色（高亮品紅）參考條帶

• 配套加樣緩沖液成分： 含有30% (w/v) 甘油、2% SDS、62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)、50 mM DTT（二硫蘇糖醇）、5 mM EDTA 以及 0.02% NaN3

產品特點

1. 優異的整體亮度與視覺穩健性

   本產品采用了先進的共價偶聯染色工藝，使得染料與重組蛋白質分子間形成穩定的結合。這不僅大幅提升了各條帶在凝膠內的初始亮度，更確保了在整個蛋白質電泳及后續的Western Blotting（蛋白質印跡）全流程中，實驗人員都能獲得強的視覺追蹤信號。無論是在凝膠成像系統的透射光下，還是在轉膜后的膜上檢測環節，其亮度表現均展現出高的可靠性。

2. 雙色設計帶來的直觀判讀體驗

   標準品中特別設定了25 kDa和75 kDa兩條粉紅色參考條帶，其余8條（10, 15, 20, 37, 50, 100, 150, 250 kDa）則為醒目的藍色。這種雙色組合打破了單色Marker在泳道中容易產生的視覺疲勞感，使得研究人員在密集的點樣孔中能夠迅速定位關鍵分子量區間，極大地提高了實驗數據的讀取效率與準確性。

3. 更強的印跡持久性與轉膜信心

   在Western Blot實驗中，普通的預染Marker往往在濕轉或半干轉過程中發生嚴重的彌散或脫落。本產品通過特殊的緩沖體系保護，賦予了蛋白條帶強的膜結合Persistence（持久性）。即便在經歷了封閉、一抗孵育、二抗結合以及多次嚴苛的洗膜步驟后，粉紅與藍色條帶依然能夠穩固地錨定在膜上。這為科研人員在化學發光顯色后重新校準目標蛋白的分子量位置提供了參照信心。

4. 寬泛的分子量覆蓋與精確的對應性

   從10 kDa的小分子多肽到250 kDa的大分子復合體，這10個重組蛋白節點均勻分布在對絕大多數天然蛋白質具有高度代表性的分子量區間內。它們不僅可用于粗略估計未知樣品的大小，還能作為內參，驗證電泳系統的分離線性度是否達標?！?/span>’

工作原理

1. SDS-PAGE 變性與電荷屏蔽效應

本產品直接上樣于聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中。在規定的上樣緩沖液和加熱變性條件下，標準品中的重組蛋白與樣本蛋白一樣，其分子內及分子間的氫鍵和二硫鍵被二硫蘇糖醇（DTT）和SDS破壞，肽鏈伸展。此時，SDS以其疏水端與蛋白質的疏水區域相結合，形成蛋白質-SDS復合物。由于SDS帶有大量負電荷，它有效屏蔽了不同蛋白質自身所帶電荷的差異，使得所有復合物均攜帶與其長度（分子量）成正比的凈負電荷。在電場驅動下，這些復合物向正極遷移，速率僅取決于其流體力學半徑，從而實現了依據分子量大小的高效分離。

2. 共價偶聯染料的實時示蹤機制

傳統非預染標準品在電泳結束后需要通過考馬斯亮藍等外部染料進行耗時較長的染色脫色才能顯色。而本產品在生產階段已將高親和力的藍色與粉紅色共價有機染料預先偶聯至各個重組蛋白上。這些染料不僅不會影響蛋白質在凝膠基質中的正常遷移率，還能使其在紫外或可見光源下直接發射出強烈的熒光或吸收特定波長的光。這使得研究人員可以在電泳運行期間，透過電泳槽的透明外殼實時監控蛋白質的分離狀態，精準把握制膠質量和停止電泳的最佳時機。

3. Western Blot 半干轉/濕轉的物理吸附與擴散平衡

在將凝膠中的蛋白質轉移至固相載體（如PVDF或NC膜）的過程中，預染染料的存在同樣至關重要。染料分子具有一定的極性和分子量，它們在轉移緩沖液中隨電流向膜移動。由于本產品的緩沖液配方經過了精細調節，確保了染料-蛋白復合物在跨過凝膠與膜的界面時能迅速且牢固地吸附在膜纖維表面。這種物理吸附力足以抵抗后續清洗步驟中的液體剪切力，從而在最終的雜交膜上留下清晰、持久的分子量標尺。

解決實驗中的哪些問題

1. 消除“盲上樣"帶來的資源浪費

   在未使用預染標準品的傳統實驗中，研究人員只能憑經驗設定電泳時間。一旦時間不足，大分子蛋白未能有效分離；一旦超時，小分子蛋白便會從凝膠底部流失。本產品充當了“進度條"，讓實驗者對分離程度一目了然，避免了因時機把控失誤而導致的珍貴樣本報廢。

2. 攻克轉膜效率“黑盒化"的困境

   Western Blot 的轉膜步驟往往是個“黑盒"，研究者難以直觀判斷大分子量的目標蛋白是否成功從凝膠轉移到了膜上。通過使用本雙色標準品，轉膜完成后只需簡單觀察膜上的粉紅與藍色條帶，即可瞬間確證轉印系統的運行狀態以及各分子量區段的實際轉移效率，從而及時調整轉膜時間與電流強度。

3. 提升低豐度靶蛋白定性的置信度

   當目標蛋白的信號較弱或背景較深時，準確判定其分子量位置變得異常困難。本產品提供的10個精準節點，特別是在25 kDa和75 kDa處具有高亮度的粉紅色標，為后期膠片分析或成像儀掃描提供了絕對的參照坐標系，有效防止了將非特異性結合誤判為目標蛋白的假陽性風險。

4. 簡化操作流程，提升實驗通量

   由于無需額外的染色、脫色步驟，本產品極大縮短了實驗周期。尤其是在需要進行快速質控篩選的高通量實驗中，直接上樣、即時觀測的特性顯著提升了整體工作效率。

使用方法

為了獲得最佳的實驗結果，請結合您的具體實驗平臺，嚴格參考以下標準化的操作流程。

1. 實驗前的準備工作

• 解凍與混勻： 使用前，請將產品從冰箱取出，置于冰上緩慢解凍。解凍后，渦旋振蕩10-15秒，確保管底無沉淀，溶液呈均一的混濁液狀態。短暫離心（如10,000 x g，10秒）以收集管壁液滴。

• 熱處理（可選但推薦）： 盡管本產品在大多數情況下可直接上樣，但為了與樣品處理條件保持一致，建議將Marker與待測樣品一同置于95℃-100℃金屬浴中加熱3-5分鐘。這有助于破壞蛋白的二級結構，使其在凝膠中呈現出最銳利的條帶。

2. 常規 SDS-PAGE 上樣操作

• 上樣量確定： 對于標準的微型凝膠（如Bio-Rad的Mini-PROTEAN系列，膠厚1.0 mm - 1.5 mm），建議單次上樣體積為 10 μl。若使用大型凝膠或制備膠，請按比例增加上樣量至15-20 μl。

• 點樣孔分配： 建議在凝膠的點樣梳齒兩側邊緣孔位以及樣品組的中間穿插點入本產品。這樣既能校正由于邊緣效應導致的彎曲，又能為中央區域的樣品提供雙向的標尺參照。

• 電泳條件： 通常使用恒壓模式。先以80V左右電壓運行至樣品壓縮成一條細線并進入分離膠，隨后將電壓升至120V-150V，直至藍色染料前沿（溴酚藍指示劑包含在緩沖液中）接近凝膠底部邊緣即可停止。

3. Western Blot 轉膜與后續處理

• 轉膜前觀察： 電泳結束后，可在白色背景的光箱上直接觀察凝膠中的雙色條帶。粉紅色條帶（25和75 kDa）應當呈現清晰的線狀，無拖尾。

• 轉膜操作： 按照常規的濕轉或半干轉程序進行。本產品的轉移效率與大多數哺乳動物蛋白質相似。

• 轉膜后確認： 轉膜完畢后，取出膜（PVDF或NC膜），在TBST緩沖液中短暫漂洗，此時即可肉眼看到膜上留下的藍/粉紅雙色階梯。以此評估轉印質量。隨后進行常規的封閉（如使用5%脫脂牛奶或BSA）和抗體孵育步驟。值得注意的是，本產品的條帶在經過ECL等化學發光底物激發時，可能會產生輕微的背景熒光，但這全不影響目標條帶的最終成像判定。

4. 特殊凝膠體系的適配

當使用梯度凝膠（如4-20%梯度膠）或非變性凝膠時，由于孔徑分布或電荷效應的差異，各條帶的相對遷移率可能會發生微小偏移。此時，建議每次實驗都隨膠跑一份本標準品，并建立該特定凝膠體系下的專屬標準曲線（Rf值與LogMW的線性關系）。

儲存條件與試劑維護

正確的儲存與維護是確保本產品長期保持活性的關鍵。

• 短期儲存（日常使用）： 開瓶后，建議存放于 4℃ 冰箱。在此溫度下，產品可保持穩定長達 6個月（或直至包裝標示的有效期，以較晚者為準）。

• 長期儲存（閑置備用）： 若預計超過6個月不使用，或為了防止頻繁凍融破壞蛋白結構，強烈建議將其分裝（如按每次用量10-20 μl分裝于低吸附離心管中），并儲存于 -20℃ 冷凍室。

• 避光要求： 盡管偶聯染料具有一定的光穩定性，但長期暴露于強光或紫外線下仍可能導致熒光淬滅。請盡量將原管保存在不透明的盒子中或鋁箔紙包裹的環境下。

• 污染防范： 由于產品中含有極微量的NaN3作為防腐劑，切勿使用嘴吸式移液器吸取，并避免與酸性溶液混合，以防產生有毒的疊氮酸氣體。操作完畢后立即蓋緊管蓋，防止緩沖液揮發導致甘油濃度升高或鹽析現象發生。

常見問題與解決方案（FAQ）

問題一：凝膠中的蛋白條帶出現明顯的“微笑"形（兩端向上彎曲）或“皺眉"形（兩端向下彎曲）彎曲。

深度剖析： 這通常并非標準品本身的質量問題，而是凝膠聚合不均或電泳過程中產生的焦耳熱導致的。

解決對策： 

• 若是“微笑"狀，多是因為兩邊緣散熱較快，導致凝膠中部溫度高于兩側，中部遷移速度快。建議降低電泳電壓（如從150V降至120V），或在4℃冷室中進行電泳以增加散熱均勻度。

• 若是“皺眉"狀，則可能是制膠時邊緣的分離膠液面不平，或者點樣孔內殘留氣泡導致局部電場畸變。制膠時需確保加入分離膠后，上方覆蓋異丙醇液面絕對水平；上樣前用微量注射器或毛細管去除點樣孔內的氣泡。

問題二：雙色條帶之間的分辨率下降，原本獨立的條帶相互融合（例如10, 15, 20 kDa擠在一起）。

深度剖析： 主要發生在分離膠濃度過高，或者上樣量超載導致蛋白帶展寬。

解決對策： 

• 檢查所配制的分離膠濃度是否過高。若目標分子量較?。?lt;25 kDa），建議使用15%或更高的分離膠，并適當延長電泳時間，讓小分子充分展開。

• 減少Marker的上樣量。有時10 μl過量，可嘗試降為5 μl，用1x SDS上樣緩沖液稀釋混勻后再上樣。

• 確保電泳緩沖液（Tris-Glycine-SDS）的pH值和離子強度正確，陳舊的電泳液會導致條帶拖尾融合，建議定期更換。

問題三：轉膜后，膜上的粉紅色參考條帶（25, 75 kDa）極淡甚至消失，但藍色條帶可見。

深度剖析： 粉紅色染料與蛋白質的偶聯化學鍵在某些pH值或高甲醇含量的轉膜液中可能發生部分解離；或者這兩種特定分子量的重組蛋白在轉膜過程中穿透了膜的孔徑。

解決對策： 

• 檢查轉膜液（Transfer Buffer）的配方。若使用的是PVDF膜，甲醇濃度通常為20%；若為NC膜，可降低至10-15%。過高的甲醇會使膜孔徑收縮過度，反而阻礙大分子轉移，同時加速染料脫落。

• 縮短轉膜時間。對于250 kDa以下的中小分子，90分鐘的濕轉（恒流200-300 mA）通常足夠。過度轉膜會導致小分子Marker穿透膜進入濾紙。

• 確保轉膜時凝膠靠近負極（黑色極），膜靠近正極（紅色極），且兩者之間沒有氣泡阻隔。

歐題四：在Western Blot最后顯色（如ECL化學發光）時，發現Marker條帶也發出了強烈的熒光信號，嚴重干擾了鄰近目標帶的觀察。

深度剖析： 本產品所含的某些染料在特定波長下可能具有類似于辣根過氧化物酶（HRP）底物氧化的特性，或者微量的DTT殘留與發光液發生了非特異性反應。

解決對策： 

• 在加入ECL等化學發光底物前，用TBST強力洗滌膜3次，每次5分鐘，去除殘留的二價鐵離子或還原劑。

• 調整曝光策略。由于Marker的發光通常是瞬態的且強度高，可以先對Marker進行一次極短時間的曝光（如1秒），記錄下條帶位置后，再針對目標蛋白進行長曝光捕捉。后期使用Image Lab等軟件進行分析時，將兩次曝光的圖層進行疊加對齊。

問題五：標準品在-20℃凍存一段時間后，解凍上樣發現條帶亮度顯著變暗。

深度剖析： 反復的凍融循環會破壞蛋白質的高級結構，導致共價結合的染料發生構象改變而失去熒光/發色能力；此外，冷凍可能導致緩沖液中的SDS結晶析出。

解決對策： 

• 嚴格遵循“小量分裝"的原則。在收到產品時，即將500 μl原液按10 μl或20 μl一份分裝到多個低吸附管中，標記好日期，每次實驗僅取出一管使用，避免反復凍融主液。

• 凍存的管子必須全解凍并充分渦旋混勻后才能使用。若發現管底有白色沉淀（SDS析出），可在37℃水浴中輕搖促溶，切勿直接上樣。

問題六：跑非變性膠（Native PAGE）時，Marker條帶彌散不清。

深度剖析： 本產品是專為變性膠（SDS-PAGE）設計的。在非變性條件下，蛋白質保持其天然折疊狀態，且帶有自身的凈電荷。SDS會改變蛋白天然電荷，本產品中的蛋白在非變性膠中遷移率極不可控。

解決對策： 

• 本產品不適用于非變性膠或等電聚焦（IEF）實驗。若需在非變性條件下測定分子量，必須購買專門用于Native條件的非變性預染Marker（如Bio-Rad的其他特定貨號產品）。

問題七：上樣孔中有大量藍色的染料殘留，未能進入分離膠。

深度剖析： 上樣緩沖液中的甘油是為了增加密度使樣品沉底，但如果Marker未充分混勻，或者點樣孔底部的凝膠存在斷層，就會導致高密度液體滯留。

解決對策： 

• 上樣前務必簡短離心并充分渦旋。

• 檢查點樣梳是否拔起過快，導致邊緣孔壁破裂?？梢杂冕橆^輕輕劃破邊緣孔壁的凝膠，幫助樣品沉降。

• 適當下調初始電壓，讓樣品在濃縮膠中充分線性壓縮后再進入分離膠。

問題八：在轉印到PVDF膜上后，進行免疫檢測時出現了高的背景噪點。

深度剖析： PVDF膜具有較強的疏水性，如果封閉不充分，血漿蛋白（本產品為重組蛋白，雖非血清來源但也屬外源蛋白）極易吸附抗體造成背景。

解決對策： 

• 轉膜前，PVDF膜必須經過純甲醇活化（通常15-30秒），隨后在轉移緩沖液中平衡5-10分鐘。未進行充分活化的膜對蛋白質的吸附極弱，容易導致Marker脫落并游離在緩沖液中，這些游離蛋白隨后會吸附在膜的其他區域。

• 加強封閉步驟。使用5% BSA（牛血清白蛋白）而非脫脂牛奶進行封閉，因為牛奶中的酪蛋白可能與某些二抗發生交叉反應。封閉時間可延長至1-2小時室溫，或4℃過夜。

問題九：使用梯度膠時，高分子量區域（如150, 250 kDa）的條帶分離效果不佳，呈球形斑點。

深度剖析： 梯度膠的底部濃度較高（如20%），大分子蛋白在其中的遷移阻力極大。如果在進入高濃度區域前電泳就停止了，它們就會堆積在交界處。

解決剖析： 

• 延長電泳時間，適當降低電壓，給予大分子足夠的遷移動力穿越高濃度凝膠網孔。

• 確保上樣體積不要過大，過大的體積會導致樣品在濃縮膠中形成柱狀而不是薄層，進入分離膠后就會形成“球形"的前沿。

問題十：Marker在儲存液中出現絮狀沉淀或分層現象。

深度剖析： 這可能是由于儲存溫度不當（如長期處于4℃但遭受頻繁震動），或者由于容器密封不嚴導致水分揮發，緩沖液鹽離子過飽和析出。

解決對策： 

• 輕微震蕩通?？梢允钩恋碇匦氯芙?。若無效，可進行低速離心（如5000 x g，1分鐘），取上清液使用。

• 檢查管蓋螺紋處是否有晶體析出，若有，說明蒸發嚴重，此管Marker已不宜用于精確定量分析，但仍可用于粗略定性觀察。后續保存務必嚴密包裹封口膜。

問題十一：進行熒光Western Blot（直接標記熒光二抗）時，發現Marker的藍色通道產生了強的串擾（Cross-talk），掩蓋了真實信號。

深度剖析： 藍色染料的最大激發/發射波長可能與某些常用熒光基團（如Cy5， Alexa Fluor 647等遠紅光染料）的激發光譜存在重疊。

解決對策： 

• 在設置熒光掃描儀的參數時，先單獨掃描Marker通道（如Cy2或FITC通道觀察藍色），記錄位置后，關閉該通道，再掃描目標蛋白的遠紅通道。

• 后期使用圖像處理軟件將Marker通道作為Overlay（疊加層）導入，手動對齊，而不是直接在同一張多色熒光圖中分析。

問題十二：懷疑Marker本身攜帶的生物素（Biotin）或Strep-tag影響了實驗結果。

深度剖析： 部分版本的Protein Standards可能帶有特定的多肽標簽（如Strep-tag II）以便于后續的特異性檢測。如果實驗體系中使用了鏈霉親和素（Streptavidin）或抗Strep-tag抗體，就會發生高背景結合。

解決對策： 

• 查閱本產品的技術參數表（Technical Datasheet）。確認1610374是否含有此類標簽。

• 若確實含有，且您的實驗涉及親和素-生物素系統，則必須更換為不含任何標簽的普通預染Marker（如Bio-Rad的Kaleidoscope標準品，貨號1610375）。

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業常規信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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